कार्डियोवास्कुलर रिसर्च के अंतर्राष्ट्रीय जर्नल

Using Na3PO4 to Enhance In vitro Animal Models of Aortic Valve Calcification

Daniel Alejandro Lerman, Sai Prasad and Nasri Alotti

Using Na₃PO₄ to Enhance In vitro Animal Models of Aortic Valve Calcification

Background/Objectives: The pathogenesis of calcific aortic valvular disease (CAVD) involves an active inflammatory process of valvular interstitial cells (VICs) characterized by the activation of specific osteogenic signaling pathways and apoptosis. This process can be studied by analyzing certain molecular markers and gene expression pathways of spontaneous calcification. The purpose of our study is to investigate the role of sodium phosphate (Na₃PO₄) as a calcification promoter, with the aim of improving in vitro animal models for testing potential calcification inhibitors.

Materials and Methods: VICs were extracted from 6 healthy 6-monthold fresh porcine hearts by serial collagenase digestion. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was used to quantify transdifferentiation of genes of interest during spontaneous calcification of VICs. Spontaneous calcification of VICs was increased by adding Na₃PO₄ (3 mM, pH 7.4). The degree of calcification was estimated by Alizarin Red staining for calcium deposition, and Sirius Red staining for collagen. Colorimetric techniques were used to determine calcium and collagen deposition quantitatively. Additionally, the enzymatic activity of alkaline phosphatase (ALP) was measured by a kinetic assay. For statistical analysis we used SPSS and Microsoft Office Excel 2013.

परिणाम: पोर्सिन VICs कैल्शियम और कोलेजन जमाव के साथ स्वचालित रूप से कैल्सीफाई हो जाते हैं। इस अध्ययन में हमने दिन 0 से दिन 14 तक कैल्शियम और कोलेजन जमाव में वृद्धि देखी (कैल्शियम: 376%; P<0.001, कोलेजन: 3553%; P<0.001)। दिन 14 तक mRNA के qPCR विश्लेषण ने निम्नलिखित परिणाम दिखाए: α-actin, मायोब्लास्ट फेनोटाइप का एक मार्कर, 1.6 गुना तक बढ़ गया था; P<0.001। Runx2, एक ऑस्टियोब्लास्ट मार्कर, 1.3 गुना तक बढ़ गया; P<0.05, TGF-β, ऑस्टियोजेनेसिस का एक प्रमोटर, 3.2 गुना तक बढ़ गया; P<0.001 P<0.001, दिन 0 पर उनके स्तरों की तुलना में। RANKL mRNA और कैलपोनिन में कोई खास बदलाव नहीं हुआ। पोर्सिन VICs को Na ₃ PO ₄ (3 mM, pH 7.4) के साथ उपचारित करने से 14वें दिन कैल्शियम जमाव में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (522%; P<0.001), और 7वें दिन ALP गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (228%; P<0.05)। 14वें दिन तक समूहों के बीच ALP गतिविधि में कोई खास बदलाव नहीं हुआ।

निष्कर्ष: इस अध्ययन ने महाधमनी VICs के स्वतःस्फूर्त कैल्सीफिकेशन के दौरान कुछ विशिष्ट अणुओं के अपरेगुलेशन को कैल्शियम, कोलेजन और ALP गतिविधि की सक्रिय वृद्धि के साथ प्रदर्शित किया है। इस इन विट्रो मॉडल में Na ₃ PO ₄ (3 mM, pH 7.4) के साथ स्वतःस्फूर्त VICs कैल्सीफिकेशन को उस स्तर तक बढ़ाना संभव था जिसमें कैल्सीफिक महाधमनी स्टेनोसिस के खिलाफ एक नई संभावित चिकित्सीय रणनीति की पहचान करने के लिए कैल्सीफिकेशन के अवरोधकों का परीक्षण किया जा सकता था।